10bp 雙鏈RNA ladder
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貨號
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名稱(chēng)
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規格
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RTM504
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10bp 雙鏈RNA ladder
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25次
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● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱(chēng)
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規格
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RTM504-01
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10bp dsRNA ladder
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100 μl
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RTM504-02
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5×RNA上樣緩沖液
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1 ml
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
10bp
dsRNA ladder由長(cháng)度20
bp至1,000
bp的10條dsRNA（雙鏈RNA）片段組成，片段大小為20，30，40，50，100，200，300，400，500，1000 bp，其中100 bp的雙鏈 RNA片段為增強帶，顯示亮帶，可作為參照。
本產(chǎn)品為雙鏈RNA
Marker，適用于非變性的PAGE電泳，不適用于變性PAGE電泳（尿素），也不建議用于瓊脂糖電泳?？梢杂糜谥苽鋝iRNA（小干擾RNA，Small interfering RNA）時(shí)標記雙鏈RNA片段大小。
按照每次上樣5
μl計算，該產(chǎn)品配制好即用型產(chǎn)品可以使用約25次。
注意：
1.由于RNA極易污染后降解，實(shí)驗操作時(shí)采取必要措施防止RNase污染，如佩戴一次性手套，使用專(zhuān)用RNase-free吸頭及離心管等；不要在同一區域進(jìn)行涉及RNase的實(shí)驗，如質(zhì)粒提取等。
2.由于dsRNA序列不同，顯示的片段長(cháng)度會(huì )略有不同；使用的siRNA片段中含有DNA片段時(shí)，片段大小會(huì )略有差異。
● 儲存條件：
-20℃ 貯存，有效期一年。
● 使用方法：
一、即用型10bp dsRNA ladder配制方法：
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即用型10bp dsRNA ladder配制量
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5 μl
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10 μl
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15 μl
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20 μl
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10bp
dsRNA ladder
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4 μl
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8 μl
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12 μl
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16 μl
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5×RNA上樣緩沖液
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1 μl
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2 μl
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3 μl
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4 μl
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注：即用型dsRNA Marker建議現用現配，不建議配制后保存，保存后會(huì )導致電泳后條帶模糊。
二、 TBE-PAGE凝膠制備：
2.1 制備凝膠步驟：
2.1.1參照凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
2.1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
注：10 bp dsRNA ladder 適用于配制15%TBE-PAGE膠。
2.1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現一個(gè)清晰的界面后，說(shuō)明凝膠已聚合。
表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
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各組份體積（ml）
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最佳dsRNA分離范圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
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2.5
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1
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1
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0.05
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0.005
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2.1.5去除覆蓋在分離膠上的乙醇；按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合；最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1mm厚度小板膠)
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各組份體積（ml） 總體積1.5 ml
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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2.1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內，避免產(chǎn)生氣泡。
2.1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì )延長(cháng)?？梢愿鶕h(huán)境溫度的不同調節APS的加入量。
2.2電泳：
2.2.1 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2.2 取待測樣品，加入相應體積5×RNA上樣緩沖液，如8 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 即用型10 bp dsRNA ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調整上樣量。
2.2.3 連接電源線(xiàn)，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。150 V穩壓電泳，至溴酚藍指示前沿距離玻璃下沿2 cm時(shí)結束電泳（參見(jiàn)下圖）。
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TBE-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時(shí)間
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150 V
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15-25
mA/板膠
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8-15 mA/板膠
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50+min
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15%T3.3C TBE-PAGE
溴酚藍前沿大小約15bp dsRNA，二甲苯菁大小約60bp dsRNA。
3、染色：
3.3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。
3.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe核酸染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）進(jìn)行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3.3染色和觀(guān)察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60 rpm染色30 分鐘。紫外光下觀(guān)察。
三、實(shí)驗示例：
15％TBE-PAGE電泳
左1：10bp DNA ladder（貨號：RTM443） 5μl
左2：20bp DNA ladder（貨號：RTM441） 5μl
左3：即用型10 bp dsRNA ladder 5μl
（4 μl 10 bp dsRNA ladder加1 μl 5×RNA上樣緩沖液）
凝膠長(cháng)度：8 cm
電泳條件：穩壓150 V 起始電流20 mA，終止電流10 mA
電泳緩沖液：1×TBE
電泳時(shí)間：50分鐘
染色：RealSafe Red核酸染料后染30分鐘