單鏈DNA Marker(15-120 nt)
貨號
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名稱(chēng)
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規格
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RTM506
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單鏈DNA Marker(15-120 nt)
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10次
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● 產(chǎn)品組成:
貨號
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名稱(chēng)
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規格
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貯存
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RTM506-01
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單鏈DNA Marker(15-120 nt)
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50 μl
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-20℃
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DL080-01
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2×TBE尿素上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
單鏈DNA Marker由6條不同長(cháng)度的單鏈DNA分子混合而成,6條帶的大小為15,40,60,80,100,120 nt,80 nt 濃度為0.4 μg/μl,其余條帶濃度為0.2
μg/μl。該Marker適用于跑尿素變性膠,電泳后使用單鏈DNA
PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5103),核酸PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5102),核酸快速高靈敏度染色試劑盒(Cat:RTS5101)或RealSafe類(lèi)核酸染料染色均可以得到清晰的條帶分離效果。
樣品保存在1×TBE尿素上樣緩沖液中,上樣方便。以每次上樣5 μl計算,該單鏈DNA
Marker可以使用大約10次。
● 保存條件和運輸:
-20℃貯存,有效期24個(gè)月;濕冰運輸。
● 使用方法:
注:以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例,其他規格凝膠請適當調整。
一. 凝膠制備:
1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒(Cat:RTE4102))或按照以下程序制膠:
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,適用于厚度1.0 mm小板膠)
單鏈DNA長(cháng)度
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最佳凝膠濃度
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尿素(克)
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40%PAA
(29:1)
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5×TBE
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補水到總體積
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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1 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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1 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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1 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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1 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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最后加入10%APS和TEMD后,立即混勻。
1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。
1.3靜置10-20分鐘,待分離膠和水層之間出現一個(gè)清晰的界面后,說(shuō)明凝膠已聚合。
注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì )延長(cháng)??梢愿鶕h(huán)境溫度的不同調節APS的加入量。
1.4去除覆蓋在分離膠上的水層;按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯中混合;最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml,適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積(ml)
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凝膠濃度
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尿素
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40%PAA(29:1)
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5×TBE
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滅菌水
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10%APS
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TEMED
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4%
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0.84克
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0.2 ml
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0.4 ml
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補水至體積2 ml
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20 μl
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2 μl
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1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端;將梳子插入凝膠內,避免產(chǎn)生氣泡。
1.6靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。
注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì )延長(cháng)??梢愿鶕h(huán)境溫度的不同調節APS的加入量。
二. 樣品制備:
2.1
取適量體積單鏈DNA
Marker樣品,70℃處理5分鐘,冰浴制冷后待上樣;待測樣品序與2×TBE尿素上樣緩沖液等體積混合后70℃處理5分鐘,冰浴制冷后待上樣。
三.電泳:
3.1. 預電泳(可選):電泳槽內外加入適量1×TBE緩沖液穩壓200 V預電泳30分鐘。電泳結束后,用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次,去除殘余的尿素。
3.2.上樣:根據梳齒確定Marker上樣量, 一般是10齒1mm厚梳子上樣5
μl,15齒1mm厚梳子上樣3
μl。
3.3. 連接電源線(xiàn),打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),按照以下條件電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時(shí)間
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適用條件
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推薦電壓
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200V
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15-20 mA/板膠
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10-15 mA/板膠
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60+ min
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最佳電壓,最優(yōu)的分辨率
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3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時(shí)終止電泳,取出凝膠進(jìn)行后續實(shí)驗。
變性膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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35 nt
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130 nt
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8%
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19 nt
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75 nt
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10%
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15 nt
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55 nt
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15%
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8 nt
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42 nt
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四.染色:
用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5103),核酸PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5102)或核酸快速銀染試劑盒(Cat:RTS5101)染色均可以得到清晰的條帶分離效果。
注:如果使用核酸染料染色,RealSafe
Red(貨號:GR002)或RealSafe
All(貨號:GR004)核酸染料結合單鏈核酸效果最佳,強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed,Goldview,EB等染色效果不好。
● 電泳示例:
1. 使用RealSafe Red核酸染料(貨號:GR002)染色:
2. 使用核酸快速高靈敏度染色試劑盒(貨號:RTS5101)染色: