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DNase I(RNase-free)

DNase I(RNase-free)

產(chǎn)品編號:RTT2104

產(chǎn)品規格:200U

數量
價(jià)格 ¥150

DNase IRNase-free

 

●  產(chǎn)品組成:

貨號

名稱(chēng)

規格

RTT2104-01

DNase I RNase-free 1 U/μl

200 U

RTT2104-02

10×DNase Reaction Buffer

0.2 ml

RTT2104-03

10×EDTA終止液(25 mM

0.2 ml

-

RNase-free

1 ml

● 保存: -20℃貯存,有效期一年。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

DNase I,即Deoxyribonuclease I,中文名稱(chēng)為脫氧核糖核酸酶I,是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物,5'端為磷酸基團,3'端為羥基。 DNase I活性依賴(lài)于鈣離子,并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下, DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn);二價(jià)錳離子存在條件下,DNase I  可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈,形成平末端,或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。該DNase I不含RNase (RNase free),可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。

用途:制備不含DNA的RNA樣品;RT-PCR反應前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染;體外T7, T3, SP6等RNA  Polymerases催化的RNA轉錄后去除DNA模板;DNase I footprinting研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用;缺口平移(nick translatioin);產(chǎn)生DNA隨機片段文庫;細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽(yáng)性對照。

活性定義:

One unit of the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C. 

DNaseI貯存緩沖液:

50mM Tris-acetate (pH7.5),10mM CaCl2,50% (v/v) glycerol

10×DNase Reaction Buffer:100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC),25mM MgCl2,1mM CaCl2

DNaseI失活或抑制:

加入EDTA至終濃度為2.5mM后,65℃加熱10分鐘可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑,達到毫摩爾/升濃度的鋅離子,0.1%的SDS,DTT、巰基乙醇等還原劑,50-100mM以上鹽濃度均對DNase I有顯著(zhù)抑制作用。

使用方法:

RT-PCR反應前RNA樣品中DNA的去除:

 1.在RNase-free離心管中加入以下溶液:

組份

10μl反應體系

備注

RNA溶液

1-3 μg

RNA加入體積小于8 μl

10×DNase Reaction Buffer

1 μl

 

DNase I (RNase-free) 1 U/μl

1 μl

 

RNase-free

補至10μl

 

 

輕柔混勻

 

2. 37oC 孵育 30 分鐘。

3. 向上述反應體系中加入 1μl 10×EDTA終止液,65oC 孵育 10 分鐘以失活 DNase I。

注:在沒(méi)有鏊合劑如 EDTA存在情況下加熱,RNA 可被水解。

4. RNA樣品即可直接用作RT-PCR反應的模板。

體外RNA反轉錄后模板DNA的去除:

1.  在每含有0.5 μg模板DNA的反轉錄反應體系中加入1U DNase I。

注:在某些情況下,模板DNA完全消化所需的DNase的量需通過(guò)實(shí)驗進(jìn)行摸索。

2.  37oC  孵育15分鐘。

3.  酚/氯仿抽提失活DNase I。

體外RNA反轉錄后模板DNA的去除:

1.  參考如下表格設置反應體系:

組份

體積

10×Reaction Buffer for DNA Polymerase I

2.5 μl

3 dNTP Mixture (1mM   each, without the labeled dNTP) *  

1.25 μl

[α-32P]-dNTP, ~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)

1.85-3.7MBq (50-100μCi)

DNase I (freshly diluted to 0.002U/μl)**

1 μl

DNA Polymerase I, E.coli

0. 5-1.5 μl (5-15 U)

Template DNA

0.25μg

RNase-free

25μl

*3 dNTP Mixture (1mM  each, without the labeled dNTP):分別取不含已經(jīng)標記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM)  各 1μl 加入到 97 μl 的RNase-free水中混勻即可。例如標記的為 dATP,則需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三種 dNTP 至每種的最終濃度為 1 mM。配制好的 dNTP 可存放于-20oC 以備后續使用。

**DNase I 可以用 1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進(jìn)行稀釋。

10×Reaction Buffer for DNA Polymerase I:500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC),100mM MgCl2,10mM DTT。

2. 立即 15oC 孵育 15~60 分鐘。

3. 上述反應體系中加入1 μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應。

4. 從中取出少量例如1 μl 檢測標記效率。通常標記效率至少可以達到 108cpm/μg DNA。


 
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