DNase I(RNase-free)
● 產(chǎn)品組成:
貨號
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名稱(chēng)
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規格
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RTT2104-01
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DNase
I (RNase-free) 1 U/μl
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200 U
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RTT2104-02
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10×DNase
Reaction Buffer
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0.2 ml
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RTT2104-03
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10×EDTA終止液(25
mM)
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0.2 ml
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-
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RNase-free水
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1 ml
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● 保存: -20℃貯存,有效期一年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
DNase I,即Deoxyribonuclease
I,中文名稱(chēng)為脫氧核糖核酸酶I,是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase
I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物,5'端為磷酸基團,3'端為羥基。 DNase I活性依賴(lài)于鈣離子,并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下,
DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn);二價(jià)錳離子存在條件下,DNase
I 可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈,形成平末端,或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。該DNase I不含RNase
(RNase free),可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。
用途:制備不含DNA的RNA樣品;RT-PCR反應前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染;體外T7, T3, SP6等RNA
Polymerases催化的RNA轉錄后去除DNA模板;DNase
I footprinting研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用;缺口平移(nick
translatioin);產(chǎn)生DNA隨機片段文庫;細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽(yáng)性對照。
● 活性定義:
One unit of
the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C.
● DNaseI貯存緩沖液:
50mM
Tris-acetate (pH7.5),10mM CaCl2,50% (v/v) glycerol
10×DNase Reaction Buffer:100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC),25mM MgCl2,1mM CaCl2
● DNaseI失活或抑制:
加入EDTA至終濃度為2.5mM后,65℃加熱10分鐘可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑,達到毫摩爾/升濃度的鋅離子,0.1%的SDS,DTT、巰基乙醇等還原劑,50-100mM以上鹽濃度均對DNase I有顯著(zhù)抑制作用。
● 使用方法:
一 RT-PCR反應前RNA樣品中DNA的去除:
1.在RNase-free離心管中加入以下溶液:
組份
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10μl反應體系
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備注
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RNA溶液
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1-3
μg
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RNA加入體積小于8
μl
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10×DNase Reaction
Buffer
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1
μl
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DNase I (RNase-free) 1 U/μl
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1
μl
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RNase-free水
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補至10μl
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輕柔混勻
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2.
37oC
孵育
30 分鐘。
3.
向上述反應體系中加入
1μl 10×EDTA終止液,65oC
孵育
10 分鐘以失活
DNase I。
注:在沒(méi)有鏊合劑如
EDTA存在情況下加熱,RNA
可被水解。
4.
RNA樣品即可直接用作RT-PCR反應的模板。
二 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除:
1. 在每含有0.5 μg模板DNA的反轉錄反應體系中加入1U DNase I。
注:在某些情況下,模板DNA完全消化所需的DNase的量需通過(guò)實(shí)驗進(jìn)行摸索。
2. 37oC
孵育15分鐘。
3. 酚/氯仿抽提失活DNase I。
三 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除:
1. 參考如下表格設置反應體系:
組份
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體積
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10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I
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2.5
μl
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3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP) *
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1.25
μl
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[α-32P]-dNTP,
~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)
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1.85-3.7MBq
(50-100μCi)
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DNase
I (freshly diluted to 0.002U/μl)**
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1
μl
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DNA
Polymerase I, E.coli
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0.
5-1.5 μl (5-15 U)
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Template
DNA
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0.25μg
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RNase-free水
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至25μl
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*3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP):分別取不含已經(jīng)標記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM) 各 1μl 加入到 97 μl 的RNase-free水中混勻即可。例如標記的為
dATP,則需混合
dTTP、dCTP
和
dGTP 三種
dNTP 至每種的最終濃度為
1 mM。配制好的
dNTP 可存放于-20oC
以備后續使用。
**DNase
I 可以用
1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進(jìn)行稀釋。
10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I:500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC),100mM
MgCl2,10mM DTT。
2.
立即
15oC 孵育
15~60 分鐘。
3.
上述反應體系中加入1
μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應。
4.
從中取出少量例如1
μl 檢測標記效率。通常標記效率至少可以達到
108cpm/μg DNA。