RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠
● 產(chǎn)品組成:
貨號
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名稱(chēng)
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規格
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貯存
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RTD6154-0308
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RealPAGE
3-8% Tris-醋酸預制膠
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10板/盒
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4-8℃
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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-
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電泳適合于分離高分子量蛋白,可以有效分離50-500 kD范圍內蛋白;電泳體系呈中性,抑制半胱氨酸的二次氧化,防止二硫鍵在凝膠中交聯(lián);在變性還原電泳中,電泳緩沖體系中加入抗氧化劑,整個(gè)電泳過(guò)程都在還原條件下進(jìn)行,有效防止二硫鍵的形成。
RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠為梯度凝膠,濃度為3-8%,厚度為1.1 mm,12齒,每個(gè)泳道可以上樣最大30 μl樣品。另外,本公司也提供Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒(貨號:RTD6155)包含預制膠、蛋白上樣、蛋白電泳、染色及轉膜所需的全部試劑。
● 貯存及運輸:
按照標簽溫度貯存;試劑盒常溫運輸。
● 使用說(shuō)明:
1. 實(shí)驗準備:
1.1 20×樣品還原劑為干粉,4℃貯存。用前加入1ml超純水震蕩徹底溶解后使用,已經(jīng)溶解的20×樣品還原劑-20℃貯存。
1.2 400×抗氧化劑為干粉,常溫貯存。用前加入15 ml超純水震蕩徹底溶解后使用,已經(jīng)溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。
2. 電泳:
注:伯樂(lè )Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell,天能VE-180,六一24K系列電泳槽請確保密封條的安裝方向(如圖)。
六一其他系列,君意東方JY-SCZ2/4,百晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準備1×電泳緩沖液:
總體積
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1000
ml
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液
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100 ml
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超純水
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900 ml
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2.2.1 外槽緩沖液:取適量體積1×電泳緩沖液用于外槽緩沖液。
2.2.2 內槽緩沖液:對于還原樣品電泳,200 ml 1×電泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑,混合均勻后用于內槽緩沖液。對于非還原樣品電泳,直接在內槽中加入1×電泳緩沖液,不要添加400×抗氧化劑。
2.3準備上樣樣品:
注:表格以配制10 μl樣品為例,其他體積按照比例調整。
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總體積10 μl
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組份
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非還原樣品
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還原樣品
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蛋白樣品
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x μl
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x μl
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5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性,非還原)
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2 μl
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2 μl
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20×樣品還原劑
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-
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0.5 μl
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超純水
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補至10 μl
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95℃ 10分鐘
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2.4電泳過(guò)程;
在電泳槽的內槽內加入1×電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭沖洗加樣孔3次;隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣,電泳。
恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時(shí)間
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150V
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40-55 mA/板膠
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25-40 mA/板膠
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60+min
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注:冰浴電泳(可選)
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3. 染色:
3.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,加入適量FastBlue蛋白染色液(以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適),搖床常溫搖動(dòng),條帶5-10分鐘即可見(jiàn)(蛋白含量高于1
μg條帶)。
3.2 搖床常溫繼續搖動(dòng)15-30分鐘至條帶清晰可見(jiàn)。
3.3 加入適量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫搖動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
3.4 觀(guān)察保存結果。
4. 轉膜:
4.1 轉印膜選擇:
Tris-醋酸凝膠轉膜可以使用NC膜和PVDF膜,需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。
4.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)配制:
將10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(濕轉,粉末型)粉末溶解于500 ml超純水中,即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型),不要調節pH,pH~7.2。
4.3 準備1×轉膜緩沖液:
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1×即用型轉膜緩沖液 配制量 1升
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10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)
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100
ml
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變性蛋白
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非變性蛋白
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<20 kD蛋白
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無(wú)水甲醇
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20%
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5-10%
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SDS
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0.01%
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0.01%
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20-80 kD蛋白
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無(wú)水甲醇
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10%
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0-5%
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SDS
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0.05%
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0.05%
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>80 kD蛋白
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無(wú)水甲醇
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10%(NC膜)
0-5%(PVDF膜)
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0%
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SDS
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0.1%
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0.1%
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超純水
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定容至1升,不要調節pH,pH~7.2
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注:甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加結合在膜上,而SDS讓蛋白更加離開(kāi)膜。因此對大蛋白轉膜來(lái)說(shuō),多加SDS,少加甲醇;而對小蛋白轉膜,多加甲醇,少加SDS。
4.4 轉膜條件:
以下轉膜條件僅供參考,客戶(hù)針對自己的目的蛋白,最好經(jīng)過(guò)1-2次預實(shí)驗后,確定最佳的轉膜條件。
膜孔徑
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蛋白大小
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穩流
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建議時(shí)間
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降溫措施
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0.22 μm
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低于20 kD
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200 mA
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~30分鐘
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不需要
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0.45 μm
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20-50 kD
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300 mA
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~45分鐘
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需要
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0.45 μm
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50-200 kD
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350 mA
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~50分鐘
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需要
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0.45 μm
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高于200
kD
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350 mA
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~2.5-4.5小時(shí)
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需要
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實(shí)驗示例: