普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號:RTP2102)
● 試劑盒內容及保存:
試劑盒組成
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RTP2102-02 (100次)
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RTP2102-03 (200次)
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貯存
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RNase
A
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300
μl
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600
μl
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-20℃
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Lysis
Dye
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600μl
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2×600μl
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室溫
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溶液P1
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30
ml
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60
ml
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室溫 (加入RNase A后2-8℃保存)
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溶液P2
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30
ml
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60
ml
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室溫
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溶液P3
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40
ml
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80
ml
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室溫
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漂洗液PW
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25
ml
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2×25
ml
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室溫
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洗脫緩沖液EB
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15
ml
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15
ml
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室溫
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質(zhì)粒吸附柱CP
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100個(gè)
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200個(gè)
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室溫
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收集管(2
ml)
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100個(gè)
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200個(gè)
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室溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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1份
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● 儲存條件和效期:
本試劑盒在室溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年;更長(cháng)時(shí)間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下,若溶液產(chǎn)生沉淀,應在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的RNase
A 在-20℃可穩定保存1年以上。加入RNase
A后的溶液P1應置于2–8℃保存,可穩定保存半年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介及使用說(shuō)明:
本試劑盒采用經(jīng)典的堿裂解法裂解細菌,再通過(guò)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結合DNA的特性,可以從1–5ml大腸桿菌LB培養液中快速提取3–20μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)??蛇m用于各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等實(shí)驗。然而,對質(zhì)粒純度要求更高的轉染實(shí)驗(要求無(wú)內毒素),此試劑盒不能達到要求。另外,盡管該試劑盒可以抽提較大的質(zhì)粒(>10kb),但我們不推薦使用。如果一定要使用,請參考以下方法:加大菌體使用量(使用5–10 ml過(guò)夜培養物),同時(shí)按照比例增加P1、P2、P3的用量;洗脫緩沖液應在70℃預熱,在吸附和洗脫時(shí)可以適當的延長(cháng)時(shí)間,以增加提取效率,其它步驟相同。
● 產(chǎn)品特點(diǎn):
使用了Lysis Dye,菌體裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經(jīng)驗,所以我們增加了Lysis Dye(一種能使裂解/中和體系變換顏色的試劑)來(lái)幫助觀(guān)察裂解/中和的程度。加入P1后,Lysis Dye使菌液變?yōu)闇啙岬募t色;加入P2后,Lysis Dye立即使溶液變?yōu)槌吻宓募t色,裂解是否完全只要觀(guān)察紅色溶液是否澄清,如果紅色非常均一,表明裂解充分;在完全裂解的體系中加入P3混勻后,體系立即變?yōu)辄S色,任何紅色的殘留表明沒(méi)有完全混勻或者中和不徹底。
● 準備工作:
1 將試劑盒附帶的RNase
A全部加入到溶液P1中(如15ml P1中加入150μl
RNase A),混勻后4℃貯存。
2 按照標簽所示在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇,混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存備用。
3 每次使用前請檢查溶液P2、溶液P3是否有沉淀生成,如果出現沉淀,37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 使用Lysis Dye的標準操作步驟:
如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1. 取1–5 ml過(guò)夜培養的菌液加入離心管中,10,000g 離心1分鐘,盡量吸除上清。
注:菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。
2. 向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1(請先檢查是否已加入RNaseA)和5μl Lysis Dye,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀,此時(shí)溶液為渾濁的紅色。
注:如果有未徹底混勻的菌塊,會(huì )影響裂解,導致提取量和純度偏低。
3. 加入250 μl溶液P2,溫和地上下翻轉6–8次使菌體充分裂解,此時(shí)溶液變?yōu)槌吻宓募t色。
注:溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免污染基因組DNA;所用時(shí)間絕對不應超過(guò)5分鐘 ,以免質(zhì)粒受到破壞;紅色溶液應該透明均一,如有渾濁紅色顆粒,表明裂解不充分,會(huì )大大降低質(zhì)粒提取效率。
4. 加入350 μl溶液P3,立即溫和地上下翻轉,充分混勻,混勻充分的標志是溶液完全呈透明的黃色,如有可見(jiàn)紅色,說(shuō)明混勻不徹底。10,000g 離心10分鐘。
注:P3加入后應立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。
左側未完全混勻,有紅色;右側完全混勻,呈均勻黃色
5. 小心地將上清轉移到吸附柱CP中(吸附柱放入收集管中),10,000g離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。
6. 向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW(請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。
7 向吸附柱CP中加入500
μl漂洗液PW,10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液。
8. 將吸附柱CP重新放回收集管中,10,000g 離心2分鐘。
注:此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,絕對不可省略,因為漂洗液中乙醇的殘留會(huì )影響后續實(shí)驗(酶切,PCR等)。
9. 將吸附柱CP置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100
μl洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,10,000g離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,-20℃保存。
注:● 為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中,再次離心收集。
● 洗脫緩沖液體積不應少于50
μl,體積過(guò)小影響回收效率。
● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內,pH值低于7.0會(huì )降低洗脫效率。
●不使用Lysis Dye的標準操作步驟:
如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1. 取1–5 ml過(guò)夜培養的菌液加入離心管中,10,000
g離心1分鐘,盡量吸除上清。
注:菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。
2. 向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1(請先檢查是否已加入RNaseA),使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。
注:如果有未徹底混勻的菌塊,會(huì )影響裂解,導致提取量和純度偏低。
3. 加入250 μl溶液P2,溫和地上下翻轉6–8次使菌體充分裂解。
注:溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免污染基因組DNA;所用時(shí)間絕對不應超過(guò)5分鐘,以免質(zhì)粒受到破壞。
4. 加入350 μl溶液P3,立即溫和地上下翻轉6–8次,充分混勻,此時(shí)會(huì )出現白色絮狀沉淀。10,000g 離心10分鐘。
注:P3加入后應立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清。
5. 小心地將上清轉移到吸附柱CP中(吸附柱放入收集管中),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。
6. 向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW(請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。
7 向吸附柱CP中加入500
μl漂洗液PW,10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液。
8. 將吸附柱CP置于收集管中,10,000g 離心2分鐘。
注:此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,絕對不可省略,因為漂洗液中乙醇的殘留會(huì )影響后續實(shí)驗(酶切,PCR等)。
9. 將吸附柱CP置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100
μl洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,10,000g離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,-20℃保存。
注:● 為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中,再次離心收集。
● 洗脫緩沖液體積不應少于50 μl,體積過(guò)小影響回收效率。
● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內,pH值低于7.0會(huì )降低洗脫效率。
質(zhì)粒提取試劑盒 RTP2101/RTP2102發(fā)表文章
1. A weird DNA band in PCR and its cause.
Author: Chang Shenghe, Sun Wei, Zhou Zhaoxi, Li Jingyang, Dai Minjie, Shu Haiyan
Product: RTP2102 普通質(zhì)粒小提試劑盒
Journal: Journal of Plant Science & Molecular
Breeding Volume 5 Article 2 2016
Institution:Haikou
experimental station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Paper link:https://doi.org/10.7243/2050-2389-5-2
2. [2017 IF=4.076] Application of Real-Time Quantitative PCR
to Detect Mink Circovirus in Naturally and Experimentally Infected Minks.
Author: Xingyang Cui, Yunjia Shi, Lili Zhao, Shanshan Gu, Chengwei Wei, Yan
Yang,Shanshan Wen, Hongyan Chen and Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質(zhì)粒小提試劑盒
Journal: Fronties in Microbiology May 2018 | Volume 9 | Article 937
Institution:College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29867846
3. [2018 IF=8.063] ATF4 destabilizes RET through nonclassical
GRP78 inhibition to enhance chemosensitivity to bortezomib in human
osteosarcoma
Author: Jie Luo, Yuanzheng Xia, Yong Yin, Jun Luo, Mingming Liu, Hao Zhang, Chao
Zhang, Yucheng Zhao, Lei Yang, and Lingyi Kong
Product: RTP2101 高純質(zhì)粒小提試劑盒
Journal: Theranostics 2019, Vol. 9, Issue 21
Institution:School of
Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University
Paper link:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31534554
4. [2020 IF=1.336] Isopentenyl Diphosphate Isomerase (IPI)
Gene Silencing Negatively Afects Patchouli Alcohol Biosynthesis
in Pogostemon cablin
Author: Wuping Yan,Yuzhang Yang,Yougen Wu,Jing Yu,Junfeng Zhang,
Dongmei Yang, Zeeshan Ul Haq Muhammad
Product: RTP2102 普通質(zhì)粒小提試劑盒
Journal: Plant Molecular Biology Reporter Published 27 January 2021
Institution:College
of Horticulture, Hainan University
Paper link:https://link.springer.com/article/10.1007/s11105-020-01269-0
5. [2022 IF=2] Genomic characterization and phylogenetic
analysis of Aleutian mink disease virus identified in a sudden death mink case
Author: Xingyang Cui, Yan Yang, Fang Wang, Jilong Luo, Ping Zhang, Hongyan Chen,
Lili Zhao, Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質(zhì)粒小提試劑盒
Journal: Comparative Immunology, Microbiology
and Infectious Diseases. Vo101, October 2023, 102052
Institution:College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0147957123001108